概述：

该试剂盒综合了Redzol和硅胶膜离心纯化柱的优点，将二者有机地结合在一起，缩短了实验时间，简化了操作步骤，能更有效地去除DNA和蛋白质的污染，使提取的RNA纯度更高、产量更多。试剂盒中每个离心纯化柱每次可处理50~100mg组织或5~10×106个细胞，在45分钟内能同时处理多个样品。纯化的RNA可用于Northern杂交、RNA点 杂交、Poly(A)+mRNA的分离、体外转录、RT-PCR、 RNase封阻分析等。

1、2泳道为Trizol试剂提取的总RNA；
3、4、5泳道为RNA提纯试剂盒提取的总RNA。

Redzol（一步法总RNA提取试剂）与总RNA提纯试剂盒提取大豆总RNA对比

试剂盒包装及组成:
1. Redzol试剂50ml
2. 硅胶膜离心纯化柱50套
3. RNA洗涤液40ml
4. DEPC处理水3ml
5. 产品说明书1份

实验前注意事项：
1. 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能 有RNase，会导致RNase污染。
2. 吸头应用DEPC处理，避免交叉污染。
3. 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿，用DEPC处理即可。

操作步骤：
1.准备
估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol 的组织用量为50~100mg；细胞用量为5~10×106个 细胞

2.组织或细胞的裂解
贴壁细胞 吸尽培养液，加入Redzol，用移液器反复吹打 数次，确保全部裂解，然后转移至新的离心管中。裂 解10cm2细胞需要1ml Redzol。
注：Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定，而 是根据细胞培养皿的面积（10cm2/ml）来决定。 悬浮细胞 离心收集细胞，吸尽液体，加入Redzol用移液 器吹打数次，确保全部裂解（某些酵母和细菌要用 匀浆器匀浆才能全部裂解），然后转移至新的离心 管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、 酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂 解细胞。
注：应避免在Redzol加入前洗涤细胞，这样会增 加mRNA降解的几率。
组织 先将新鲜组织剪成小块，放入匀浆器内，加入 Redzol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。或者将组织在液氮中研磨成粉末后，加入Redzol 中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。
注：样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。

3.分相 a. 将匀浆液15~30℃静置5分钟使其充分裂解。 b. 每1ml Redzol中加入0.2ml的三氯甲烷（氯 仿），震荡混匀后15~30℃静置2~3分钟。 c. 12,000rpm离心15分钟。离心后混合物分成 三相（下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上面 的无色水相）。RNA全部在无色的水相中。 注：对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素 （肌肉、脂肪组织、植物的微管组织）的样品，在 分相前可以附加一个分离步骤，匀浆后12,000rpm 离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液中，纤维 素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从 而与RNA分离。对于脂肪组织的样品，上面一层 脂肪组织可以被清除掉，将清澈的匀浆液转移到 另一新管中，继续进行第3步分相。

4.柱纯化 a. 转移上层水相到另一新的1.5ml离心管中， 加入200μl无水乙醇，颠倒混匀。 b. 将混合液吸入离心纯化柱（硅胶膜）中，静 置3分钟，12,000rpm离心2~3分钟。 c. 倒掉收集管中的废液，将离心纯化柱重又套 入收集管中。加入600μl RNA洗涤液，12,000rpm离 心1分钟，倒掉收集管中的废液。 d. 12,000rpm再离心2分钟，尽量除尽液体。将 离心纯化柱套入干净的1.5ml离心管中，加入50μl DEPC处理的超纯水或0.5% SDS于离心纯化柱正中 （不要粘在管壁上），静置1~2分钟，12,000rpm离心 1分钟。 e. 将洗脱液吸入离心纯化柱中再洗脱一次，以提高RNA的回收量。洗脱下来的液体即是纯化的 RNA，-20℃保存。

常见问题解答：

每mg组织或106培养细胞的RNA产率：

肝和脾6~10μg

肾3~4μg

骨骼肌和脑1~1.5μg

胎盘1~4μg 上皮细胞5~8μg

纤维原细胞5~7μg

RNA产率低：

样品裂解或匀浆不完全；提取的RNA溶解不 完全。

A260/A280<1.65：

紫外检测时RNA样品应用水稀释，不能用TE 稀释，低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm 的吸收值增加（Wilfinger, W. et. al, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37）；样品 匀浆时加入Redzol试剂体积太少，匀浆后溶液分层 不明显，水相被酚污染；最后提取的RNA样品不能 完全溶解。

RNA降解：

使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol 中匀浆；分离使用的样品或制备的RNA长期贮存 在-5~-20℃，而不是贮存在-60℃~-70℃；提取RNA 的细胞被胰蛋白酶分解，易导致提取的RNA降解； 水相或使用的离心管仍残留有RNase；变性凝胶电 泳使用的甲醛pH值低于3.5。

DNA污染：

样品匀浆时加入试剂体积太少；分离使用的样品 含有有机溶剂（乙醇，DMSO等），盐离子或碱溶液。