概述：

本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA 第一链所需要的全部试剂，同时根据实验的不同要 求及目的提供了两种合成cDNA 第一链的引物： oligo(dT)18和随机九聚物(dN)9。试剂盒中的M-MLV 反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶，该酶 是鼠白血病毒的pol基因的产物，由分子量为71kD 的单个亚单位组成，具有很弱的RNase H活性。在 M-MLV反转录酶作用下，利用oligo(dT)18或者随机 引物(dN)9合成与mRNA相应互补的cDNA第一链。

试剂盒包装及组成: 25次

1. M-MLV Reverse Transcriptase（200U/μl） 2500U/12.5μl
2. 5×M-MLV Buffer 100μl
3. 100mM DTT 50μl
4. dNTPs（10mM each） 25μl
5. RNasin（40U/μl） 250U/6.25μl
6. Oligo(dT)18（20pmol/μl） 0.5OD/tube
7. (dN)9（20pmol/μl） 0.5OD/tube
8. DEPC-treated water 1.5ml

操作方法：

1、逆转录反应

（1）在无菌薄壁管中加入以下成份： Total RNA 0.5~1.0μg (dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
（2）混匀后，70℃变性5min，将薄壁管迅速置于冰 上冷却，然后依次加入以下成份： 5×M-MLV Buffer 4μl dNTPs（10mM each） 1μl RNasin 10U100mM DTT 2μl M-MLV Reverse Transcriptase 100U DEPC-treated water up to 20μl
（3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃， 使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。
（4）94℃ 5min终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进 行其它下游操作。

2、PCR扩增

（1）在PCR薄壁管中加入以下试剂 Synthesized cDNA 2-5μl 10×PCR Buffer 2μl Upper primer 10pmol Lower primer 10pmol dNTPs（10mM each） 0.5μl Taq DNA Polymerase 1.5U ddH2O up to 20μl
（2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。 94℃预变性2.5min。进入下列30~40个循环（此扩 增条件仅供参考）：94℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。

注意事项：

1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性 可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检 测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8 ~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物 RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否 则，表明有RNA降解。

2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、 试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。 　　3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12-18 作为反转录引物，可保证cDNA具有完整的3'端， 通常可得到接近全长的cDNA第一链；若选择随 机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物，引物在整个 mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的 cDNA第一链。这种方法经常用于获得5'末端序 列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复 制的终止位点的RNA模板获得cDNA。

常见问题及参考意见：

1、cDNA产量很低，为什么？ 可能的原因：

(1)RNA模板质量低；
(2)对mRNA 浓度估计过高；
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；
(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。

2、合成不了长链的cDNA，为什么？

(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干 热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时， 在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应 条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）、 DTT浓度（0.5~10mM）。
(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度，或者使 用随机引物。

注：经本公司实验证明某些DEPC处理水可能 对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此PCR扩增时 建议最好使用超纯水。