概述：

本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA 第一链及PCR扩增所需要的全部试剂，同时根据实 验的不同要求及目的提供了两种合成cDNA第一链 的引物：oligo(dT)18和随机九聚物(dN)9。试剂盒中 的M-MLV反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚 合酶，该酶是鼠白血病毒的pol基因的产物，由分 子量为71kD的单个亚单位组成，具有很弱的RNase H活性。在M-MLV反转录酶作用下，利用oligo(dT)18 或者随机引物合成与mRNA相应互补的cDNA第一 链，然后以cDNA为模板利用本试剂盒提供的PCR 相关产品进行PCR扩增。本试剂盒含有从RNA到 cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部 试剂，可以简便而有效地对RNA进行扩增分析。

1、2泳道为Trizol试剂提取的总RNA；
3、4、5泳道为RNA提纯试剂盒提取的总RNA。

cDNA第一链合成试剂盒与两步法RT-PCR试剂盒扩增结果电泳图

试剂盒包装及组成:25次

1. M-MLV Reverse Transcriptase（200U/μl） 2500U/12.5μl
2. 5×M-MLV Buffer 100μl
3. 100mM DTT 50μl
4. dNTPs（10mM each） 37.5μl
5. RNasin（40U/μl） 250U/6.25μl
6. Oligo(dT)18（20pmol/μl） 0.5OD/tube
7. (dN) 9（20pmol/μl） 0.5OD/tube
8. DEPC-treated water 1.5ml
9. Taq DNA聚合酶（5U/μl） 50U/10μl
10.10×PCR Buffer 50μl

操作方法：

1. 逆转录反应

（1）在无菌薄壁管中加入以下试剂 Total RNA 0.5～1μg (dN)9 or oligo(dT)18 100pmol

（2）混匀后，70℃变性5min，将薄壁管迅速置于冰 上冷却，然后依次加入以下试剂：

5×M-MLV Buffer 4μl

dNTPs（10mM each） 1μl

RNasin 10U 100mM DTT 2μl

M-MLV Reverse Transcriptase 100U

DEPC- treated water up to 20μl

（3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃， 使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。

（4）94℃ 5min终止反应后，冰上冷却。

（5）合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进 行其它下游操作。

2. PCR扩增

（1）在PCR薄壁管中加入以下试剂

Synthesized cDNA 2-5μl

10×PCR Buffer 2μl Upper primer

10pmol Lower primer 10pmol

dNTPs(10mM each) 0.5μl

Taq DNA Polymerase 1.5U

ddH2O up to 20μl

（2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。 94℃预变性2.5min。进入下列30~40个循环（此 扩增程序仅供参考）：94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。

注意事项：

 1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性 可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检 测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为 1.8~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生 物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1， 否则，表明有RNA降解。

2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、 试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套 以杜绝各种RNA酶的污染。 　　3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12～18作为反转录引物，可保证cDNA具有完整的3'-端，通常可得到接近全长的cDNA第一链；若选择随机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物，引物在整个mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的cDNA第一链。这种方法经常用于获得5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获cDNA。

常见问题及参考意见：

 1、cDNA产量很低，为什么？可能的原因：

(1)RNA模板质量低；

(2)对mRNA 浓度估计过高；

(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂 或反转录酶量不足；

(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。

2、合成不了长链的cDNA，为什么？

（1）RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干 热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时， 在逆转录反应中加入RNase抑制剂。

（2）反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反 应条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）、 DTT浓度（0.5~10mM）。

（3）RNA结构问题。提高逆转录反应温度，或者使 用随机引物。