简 介
傻瓜RT-PCR反应体系包含了进行逆转录 mRNA 为cDNA及PCR扩增DNA的各种反应物，两步反应在同一管中进行。

优势与特色
时效性：显著缩短建立反应所需的时间。
稳定性：傻瓜逆转录反应体系包含有逆转录酶稳定剂，所以逆转录酶的活力和稳定 性是极其有保障的。若贮存在-20℃有效期达2年，室温贮存稳定性超过一个月，95℃为20分钟，预变性对酶活性无影响。
准确性：在大批量反应中，傻瓜逆转录反应体系在数千次反应体系中都能得到一致的结果，严格的功能质量检测显示出高度的一致性，与标准反应相比产物量更高。
简易性：每个管中都含有指示染料和沉淀剂以便琼脂糖凝胶电泳，并省略了样品与上样缓冲液混合等步骤。
防污染：在常规RT/PCR实验中，由于反复冻融和抽取，可能导致试剂的浪费和交叉污染，增加出错的几率，使用本系统则最大限度地减少此类问题的发生。

实验方法
1. 据下表将适当浓度的模板RNA和反向引物混合在DEPC处理过的管中。

模板RNA和引物在反应体系中的用量 ：

2. 将其70℃温育5分钟后放置冰上。
3. 将其和正向引物加入到傻瓜RT-PCR反应管中，并用DEPC处理水补足到相应的反应体积。
4. 通过振荡将冻干物完全溶解，然后短暂离心。
5. 加少许矿物油（若使用带加热盖的PCR仪，可省略此步骤）。
6. 根据下列推荐的条件进行cDNA合成
42℃，60分钟（cDNA合成）
94℃，5分钟（反转录酶失活）

RT PreMix与RT-PCR PreMix扩增结果电泳图
1、2泳道为RT PreMix合成cDNA后的扩增结果 （扩增片段1.5kb）；
3、4泳道为RT-PCR PreMix的扩增结果 （扩增片段1.5kb）。

常见问题及参考意见:

 1. RNA结构特点及RNase的作用？ RNA是由4种（2'未脱氧的）核苷酸A、U、 G、C的单链构成的聚合物。2'-OH对RNA分子 的理化性能有重要影响：
（1）RNase对RNA的降 解作用通过2'-OH进行，不再需要DNase必须的 工作金属离子的参与便可完成；
（2）RNA分子在 强碱条件下，通过2'-OH参与形成2'、3'磷酸二 酯（环）自发水解，因此在无RNase的水溶液中 其稳定性也远远低于DNA；
（3）RNase为较小的单肽链蛋白，尤其是具有较多的二硫键（4对）， 使得RNase的结构特别紧凑，100℃ 20分钟也不 会失活，高压灭菌也不会使之变性。因此，RNA 极易受RNase的攻击而降解，导致实验失败。

2. 操作RNA注意事项？
由于RNA 酶的高稳定性、广泛存在性和 RNA的不稳定性，在有关RNA操作的实验中须 十分小心。

（1）指定特定的区域作为操作RNA专用区，保持实 验室低温、清洁的环境，减少空气流动，实验 前用RNA酶灭活剂和75%乙醇擦拭实验台。
（2）实验过程中需戴口罩及一次性手套，接触可能 污染RNA酶的物品后要更换手套。
（3）对于内源RNase的抑制，根据实验特点采取不 同方法。如体外转录、合成cDNA第一链等实 验，加入RNase的专一抑制剂（RNasin）；对于 RNA的分离制备采用非特异的蛋白变性剂，如 异硫氰酸胍-巯基乙醇联合变性的方式等。
（4）对于外源RNase，凡不能用高温烘烤的材料如 塑料容器等，通常用0.1% 的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液37℃浸泡12小时以上，高温灭 菌并烘干后使用。DEPC是RNA酶的化学修饰 剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反 应而抑制酶活性。所用玻璃器皿需置于干燥烘 箱中200℃烘烤2小时以上或180℃烘烤12小时 以上，冷却备用。 实验所用试剂也可用DEPC 处理，加入 DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再 煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC， 否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活 性。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处 理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。注意： DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使 用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应，因而含 Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
（5）用作RNA分析的电泳槽要用1%SDS清洗，用 水冲洗后，然后用无水乙醇清洗，最后用3%双 氧水浸泡10分钟。使用前再用DEPC处理水冲 洗电泳槽。

3. cDNA产量很低，为什么？
可能的原因：
（1）RNA模板质量低；
（2）对 mRNA浓度估计过高；
（3）反应体系中存在反转 录酶抑制剂或反转录酶量不足；
（4）反应体积过 大，一般不应超过50μl。

4. 进行RT-PCR实验时，产生弥散条带，为什么？
（1）在PCR反应体系中第一条链产物的含量过 高；
（2）引物的用量过高；
（3）没有优化PCR反 应条件及循环参数；
（4）在用DNase处理被DNA 污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产 生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

5. 进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物，为什么？

6. 进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到非特异性扩增产物，为什么？